Луи (Louis, евр. имя Арье-Лейб) Бернстайн родился 25 августа 1918 года в Лоуренсе, штат Массачусетс, в еврейской семье, приехавшей из Ровно (Украина): мать Дженни (урождённая Резник), отец Самуил Иосиф Бернстайн, оптовый поставщик парикмахерских товаров (по некоторым источникам, владел книжным магазином). Бабушка настояла, чтобы ребёнка назвали Луи, но родители всегда называли его Леонардом. Он официально сменил своё имя на Леонард в возрасте пятнадцати лет, вскоре после смерти своей бабушки. Для своих друзей и многих других он был просто «Lenny».
Отец сначала не поощрял интерес молодого Леонарда к музыке, хотя и брал мальчика на концерты и в конечном счёте поддержал его музыкальное образование. В юности Бернстайн собирался стать пианистом.
Уроки игры на фортепиано Бернстайн начал брать ещё в детстве, учась в гарнизонной и Бостонской латинской школах. Изучал композицию в Гарвардском университете у Уолтера Пистона, Эдварда Берлингейма-Хилла и А. Тиллмана Меррита. Ещё до окончания университета в 1939 году Бернстайн неофициально дебютировал как дирижёр со своей собственной музыкой к «The Birds», а также играл и дирижировал в «The Cradle Will Rock» Марка Блитцстайна (Marc Blitzstein). Позже учился в Кёртисовском институте музыки у Фрица Рейнера (дирижирование), Рэндалла Томпсона (оркестровка), Рихарда Штёра (контрапункт) и Изабеллы Венгеровой (фортепиано).
В 1940 году Бернстайн учился в летней школе при Бостонском симфоническом оркестре (Тэнглвудский музыкальный центр) под руководством Сергея Кусевицкого, а позже стал его помощником.
Ассистент дирижёра (1943—1944), дирижёр (1957—1958), главный дирижёр (1958—1969) Нью-Йоркского филармонического оркестра (где стал преемником Бруно Вальтера) и городского оркестра «Нью-Йорк сити симфони» (1945—1948).
В 1953 году Бернстайн стал первым американским дирижёром в «Ла Скала», сотрудничал с Марией Каллас.
22 августа 1959 года в Большом зале Московской консерватории состоялось открытие концертного тура Нью-Йоркского оркестра под руководством Леонарда Бернстайна. Этот тур включал семнадцать стран (три недели в СССР) и пятьдесят концертов. Заключительный концерт исполнялся в Белом Доме, Вашингтон.
Обладатель Премии Сименса (1987). Автор книг «Радость музыки» (The Joy of Music, 1959) и «Бесконечное разнообразие музыки» (The Infinite Variety of Music, 1966), «Концерты для молодежи» (Young People’s Concerts), «Вопрос без ответа» (The Unanswered Question, 1976), «Открытия» (Findings, 1982).
В 1971 году был введён в национальный Зал славы авторов песен.
В начале 1990 года по состоянию здоровья Бернстайн был вынужден отменить несколько выступлений в США и Японии. Последний раз он дирижировал 19 августа в Тэнглвуде, штат Массачусетс, когда Бостонский симфонический оркестр исполнял «Четыре морские интерлюдии» Б. Бриттена и Седьмую симфонию Бетховена. При исполнении третьей части симфонии у дирижёра начались приступы кашля (он не мог избавиться от привычки курить).
Умер от сердечного приступа 14 октября 1990 года. Похоронен на кладбище Грин-Вуд в Нью-Йорке.
